天麻素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力和海马p53表达的影响

摘要】  目的： 探讨天麻素对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆能力和海马p53表达的影响。方法: 将大鼠随机分成模型组、对照组、治疗组(高剂量天麻素组和低剂量天麻素组)，采用改良Pulsinelli四血管闭塞法(4VO)建立VD大鼠模型，天麻素高剂量组模型大鼠用天麻素80 mg·kg-1·d-1灌胃，天麻素低剂量组模型大鼠用天麻素40 mg·kg-1·d-1灌胃，连续4周。水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力，免疫组织化学检测大鼠海马p53免疫反应阳性细胞表达。结果: 与VD模型组比较，天麻素治疗后VD大鼠学习记忆能力明显提高，海马p53免疫阳性神经元明显减少(P < 0.01)，以高剂量天麻素组效果更显著。结论: 天麻素可改善VD大鼠学习记忆能力，其机制可能与下调p53表达、抑制缺血海马神经细胞的凋亡有关。

【关键词】  痴呆，血管性; 海马; 蛋白质p53; 迷宫学习; 记忆; 天麻素

The Effect of Gastrodine on Learning Capability, Memory and p53　Expression in Hippocampus of Vascular Dementia Model Rats

　　GAO Dongli, PAN Ya, LI Yongjiang, CHEN Can, ZHANG Min

　　(Department of Physiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To study the effect of gastrodine on learning capability, memory and expression of p53 in hippocampus of vascular dementia (VD) model rats. Methods： The experimental rats were randomly divided into four groups: VD model group (group V), control group (group C), and high dose (group H) and low dose (group L) of gastrodine treatment groups. VD models were established with improved Pulsinelli four vessel occlusion (4VO)method. Gastrodine was administered intragastrically with doses of 80 mg·kg-1·d-1 and 40 mg·kg-1·d-1 to rats in groups H and L respectively daily for 4 weeks.Learning and memory abilities of rats in 4 groups were evaluated with Morris Water Maze test，and the expressions of p53 proteinum in hippocampus dentate gyrus (HDG) were examined by immunohistochemistry method. Results： The learning and memorizing abilities were significantly improved in groups H and L compared with those of group C. Expression of p53 was lower in both treatment groups, than that of group C (P<0.01), and treatment of high dose gastrodine was even more effective. Conclusions: Gastrodine can improve the learning and memorizing abilities of VD model rats. The downregulation of p53 and inhibition of ischemia hippocampus nerve cell apoptosis might be potential mechanism for the improving effects of gastrodine.

　　[Key words] dementia,vascular; hippcampus; protein p53; maze learning; memory; gastrodine

　　血管性痴呆(Vascular Dementia，VD)是指由脑缺血缺氧所引起的获得性智能损害综合征，是老年期痴呆的主要类型之一。脑缺血后神经细胞死亡除有坏死外，还存在凋亡形式，因此抑制缺血后神经细胞凋亡对保护神经元具有重要意义。p53是促凋亡基因之一 ，在DNA损伤、癌基因的激活等能发挥重要作用[1]。天麻素(Gastrodin，Gas)是从天麻中提炼出的主要有效成分，药理实验证明有较强的生物活性[2]。2008年7月～2009年4月用天麻素灌胃处理VD大鼠，观察大鼠学习记忆能力及大鼠海马p53表达水平，探讨天麻素对VD的影响及其分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　健康、雄性SD大鼠80只，4～5月龄，体重300～330 g，由贵阳医学院实验动物中心提供[合格证号：SCXY(黔)2002-0001]。p53检测试剂盒由北京中衫金桥生物技术有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组和造模 大鼠随机分成4组，对照组、模型组、天麻素高剂量组、天麻素低剂量组，每组20只。采用改良Pulsinelli四血管阻断法建立VD动物模型[3]。模型组、天麻素高剂量组及天麻素低剂量组烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞，24 h后夹闭双侧颈总动脉，5 min /次，共3次，每次间隔1 h。对照组除不烧灼椎动脉和夹闭颈总动脉外，其余步骤同前。模型制作完成后，高剂量组按80 mg·kg-1·d-1 (2 ml)给予天麻素灌胃，低剂量组按40 mg·kg-1·d-1 (2 ml)给予天麻素灌胃;对照组及模型组给予等量生理盐水。每天1次，共4周。

　　1.2.2 学习记忆能力测试 各组大鼠于造模后第4周开始进行Morris水迷宫实验。第1～6天行定向航行试验，每日将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序从各入水点(各象限水池壁中点)靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期;第7天行空间探索试验，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录2 min内大鼠在第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数。

　　1.2.3 p53的表达 水迷宫测试后，大鼠麻醉，经左心室插管，分别用生理盐水、10%中性甲醛灌注固定，注毕断头取脑，置于10%中性甲醛液中浸泡固定。取海马齿状回记录点前后约3 mm厚标本，经梯度脱水、透明及石蜡包埋后，行冠状位切片，片厚4～5 μm。免疫组织化学PV二步法检测大鼠海马p53，严格按试剂说明书操作。切片脱水、透明、中性树胶封片后，采用Leica摄像显微镜采图，ImagePro Plus 6.0专业图像分析系统分析，每张切片随机取5个视野，每个视野采集一幅图像，进行平均光密度(AOD)测量，取平均值作为最后结果。

　　1.2.4 统计学处理 应用SPSS 11.5统计分析软件，数据以x±s表示。先进行单因素方差分析，组间差异采用SNK检验进行分析。

　　贵阳医学院学报 34卷 4期高冬丽等 天麻素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力和海马p53表达的影响

         2 结果

　　2.1 学习记忆能力

　　定向航行实验中的平均逃避潜伏期反映大鼠的学习能力，结果见表1。模型组大鼠平均逃避潜伏期与对照组比较明显延长(P<0.05或P<0.01)天麻素组与模型组相比，平均逃避潜伏期缩短(P<0.01)。高剂量组与低剂量组比，从第2天开始平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索实验反映大鼠的记忆能力，结果见表2。模型组与对照组比较，第Ⅲ象限活动时间缩短、穿越站台次数减少(P<0.01)。天麻素组与模型组比较，第Ⅲ象限活动时间延长、穿越站台次数增多(P<0.01，P<0.05)。高剂量组与低剂量组比较，第Ⅲ象限活动时间显著延长，穿越站台次数增多(P<0.01，P<0.05)。表1 各组大鼠定向航行实验平均逃避潜伏期(　表2 各组大鼠空间探索实验第Ⅲ象限活动时间和穿站台次

　　2.2 p53阳性神经元

　　各组大鼠海马齿状回颗粒细胞层p53阳性神经元表达结果见图1和图2。p53免疫反应阳性产物为神经元胞核内棕黄色沉淀物，少量分布在胞浆内。对照组神经元胞核p53免疫反应阳性产物明显减少，染色极浅(图2A)，模型组大鼠海马齿状回颗粒细胞层有较为密集的p53免疫阳性神经元分布，染色深(图2B)。天麻素组神经元细胞核p53免疫反应阳性产物明显减少，染色较浅，与低剂量组比较，高剂量组神经元细胞核内p53免疫阳性反应颗粒表达水平少，染色浅，两者AOD值差异明显(P<0.05)。见图2C、2D。

　　3 讨论

　　天麻为兰科多年寄生草本植物天麻(Gastrodia elata Blume)的干燥块茎，对眼黑头眩、四肢拘挛、小儿风痫、蛊毒恶气等具有良好功效。天麻素(gastrodin)为天麻的主要成分，又称天麻苷，化学名为对羟甲基苯β D 吡喃葡萄糖苷，含量为0.33%～0.67%，药理实验证明天麻素有较强的生物活性，常作为衡量天麻药材和制剂质量的指标成分。近年来，对天麻素的药理作用及机制研究也越来越受到关注，一般认为，天麻素对神经元保护作用及延缓细胞衰老的作用可能与其具有清除自由基、改善脑循环、抑制兴奋性氨基酸诱导的细胞死亡和凋亡的能力有关[4,5]。本实验发现，模型组大鼠找到站台的时间比对照组大鼠明显延长;第7天撤去站台后，模型组大鼠第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数比对照组明显减少，寻找站台的轨迹以穿梭游泳和环池游泳为主。结果表明，模型组大鼠学习记忆能力较对照组明显减退，运用4VO改良法成功复制了VD模型大鼠。用天麻素治疗后，大鼠找到站台的时间较模型组明显减少，以穿梭游泳和绕站台游泳为主，学习记忆成绩和游泳轨迹接近对照组，提示天麻素能有效改善VD大鼠的学习记忆能力，尤其是高剂量组大鼠的选择正确率显著提高，治疗效果更佳。

　　近年来的研究显示，随着缺血性损伤严重性和持续时间等的不同可导致不同程度的神经元坏死和凋亡[6，7]。目前公认p53是最常见的促凋亡基因之一 ，p53及其相关基因在脑缺血中的表达调控已成为目前缺血神经元死亡机制中的一个关键性环节。VD的重要病因是大脑缺血缺氧，海马是缺血性脑损伤中最敏感的脑区，VD发病时海马存在明显的细胞凋亡，其发生的病理基础是弥漫性或局灶性脑缺血引起海马结构或与海马记忆相关的联系通路的神经细胞凋亡，且凋亡细胞越多痴呆越严重。有实验研究，脑缺血促进p53的表达，在介导缺血性神经元损伤中起重要作用[8]。因此认为，检测大鼠海马组织中p53蛋白的表达情况，可作为反映脑缺血大鼠脑组织神经元凋亡的间接指标。本实验结果显示，模型组大鼠海马齿状回颗粒细胞层有较为密集的p53免疫阳性神经元分布，神经元胞核内有丰富p53免疫阳性反应沉淀物，染色深。治疗组神经元胞核p53免疫阳性神经元明显减少，p53免疫阳性沉淀物染色较浅，以高剂量天麻素效果更显著。实验结果提示应用天麻素有拮抗细胞凋亡的作用，可抑制脑神经细胞凋亡的发生，显著下调p53促凋亡基因，对痴呆模型大鼠脑内与学习记忆密切相关的海马区的神经元起到了保护作用。认为其下调p53促凋亡基因的可能机制与降低兴奋性氨基酸的神经毒性、拮抗神经元细胞凋亡、对缺血再灌注损伤的保护作用、抑制神经细胞损伤、增强免疫及抑制氧自由基系统代谢紊乱有关[9～11]。也有资料表明p53 基因参与促凋亡蛋白Bax的表达[7]。研究已证实p53是bax基因的直接转录因子,其水平升高可以引起随后bax基因表达增加，导致膜通透性增加，细胞色素C由线粒体释放入胞浆，激活天冬氨半胱氨酸酶(caspase)系统，诱导凋亡[12]。因而，p53在缺血诱导凋亡的过程中发挥重要的调控作用。

　　所以，拮抗缺血性脑病所致痴呆病人神经元细胞的凋亡，增强海马神经元抗缺氧及抗自由基损伤的能力，改善脑缺血状态,可能是天麻素改善痴呆症状的作用机理之一。本实验结果显示高剂量天麻素组的各项指标均优于低剂量天麻素组，提示高剂量天麻素比低剂量天麻素作用效果更强，在改善学习记忆能力、对抗VD症状更显著。但天麻素是通过何种途径降低VD大鼠海马p53的表达，尚值得进一步研究。